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盘龙参种子快繁技术研究

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摘要:以盘龙参蒴果为外植体,进行组织培养快繁试验,采用对比试验研究不同基本培养基、激素浓度的配比、天然添加物对盘龙参种子萌发、原球茎增殖、分化的影响,从中筛选出离体条件下适宜种子萌发、种苗快繁的培养基配方。结果表明,外植体最佳消毒方案是采用75%乙醇浸泡30s结合0.1%HgCl2浸泡20min。最适合的种子萌发诱导培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁15%;原球茎在1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁15%的增殖效果最好,增殖率为380%;最适合盘龙参原球茎分化的培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁20%。

关键词:盘龙参;种子;原球茎增殖;组培

快繁体系盘龙参(Spiranthessinensis),又名绶草、龙缠柱,是兰科绶草属多年生陆生兰类,全世界共50种,我国仅有1种,生于海拔200~3400m的山坡林下、灌丛下、草地或河滩沼泽草甸中[1]。据民间草药记载,盘龙参其根或全草入药,用于病后气血两虚、少气无力、气虚白带、遗精、失眠、燥咳、咽喉肿痛、缠腰火丹、肾虚、肺痨咯血、消渴、小儿暑热症;外用于毒蛇咬伤、疮肿等[2]。现代药理研究表明,盘龙参含有二氢菲类、黄酮类、苯丙素类、阿魏酸二十醇酯、甾醇等多种药理活性成分,具有明显的抗病毒、抗肿瘤作用[3]。盘龙参除药用外,因其花序有如红龙或青龙般盘绕在花茎上,花形别致奇特,美丽玲珑,可用于园林布景或作为袖珍盆景近距离观赏,是极具药用、观赏价值的经济植物。近年来人们对盘龙参过度采挖,使得其野生资源数量迅速下降,已被《野生植物保护名录》列为国家二级保护植物、国际濒危植物[4]。由于盘龙参种子微小,自然萌发率和繁殖率极低,人工栽培比较困难,目前关于盘龙参组织培养的报道较少,牛玉璐等[5]以盘龙参肉质根、幼叶、花序轴为外植体,比较发现花序轴是比较理想的外植体,诱导率达83%。李家敏[6]和宋洪文[7]均做了外植体消毒灭菌试验,李家敏以花梗顶端5cm为外植体,认为75%酒精浸30s的处理效果好,宋洪文以花梗腋芽为外植体,认为外植体用75%酒精浸8s,0.1%升汞消毒8min效果最好。丁兰等[8]以种子为外植体,结果表明种子诱导萌发形成种苗的仅3%,盘龙参种子在无植物生长物质的培养基中能够萌发,但不能发育成苗;在含有1.0mg/LKT、0.1mg/LIAA和0.1mg/LGA3的培养基中萌发,并能进一步发育形成种苗;在较高浓度生长素(1.2mg/LNAA)的培养基中不能萌发;种苗在较高浓度细胞分裂素(12.0mg/L)和较低浓度生长素(0.1mg/L)配比的培养基中能够增殖,最高增殖系数可达到2.8。为提高盘龙参种子萌发率和原球茎增殖率,本文作者以四川省乐山市采集的盘龙参种子为外植体,拟通过正交设计的方法研究几种因素对其种子组培快繁的影响,建立人工快繁技术体系,为保护、开发和利用盘龙参资源提供具有实用价值的资料。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为盘龙参成熟蒴果内种子,采自四川省乐山市。

1.2试验方法

1.2.1培养基配制采用1/2MS:主要是大量元素和微量元素减半,铁盐、有机物不变;马铃薯提取液(potatoextract,PE):称取定量的马铃薯加适量水用家用搅拌机打成浆,和煮化的琼脂蔗糖共同加热后加入配制好的基本培养基,定容分装后高压灭菌;香蕉提取液(bamanaextract,BE):熟香蕉去皮后加适量水用家用搅拌机打成浆,和煮化的琼脂蔗糖共同加热后加入配制好的基本培养基,定容分装后高压灭菌。苹果汁(appleextract,AE):苹果去皮后加适量水用家用搅拌机打成浆,和煮化的琼脂蔗糖共同加热后加入配制好的基本培养基,定容分装后高压灭菌。

1.2.2外植体消毒5月间采集成熟、未开裂的盘龙参蒴果,刮除表面微绒毛,在流水下冲洗2h后用无菌水冲洗3遍;然后在无菌条件下取出,用质量浓度为75%的酒精消毒30s,0.1%HgCl2浸泡(处理时间10min、15min、20min、25min、30min、35min),共6个处理。浸泡消毒过程中轻微振荡,以提高消毒效果,浸泡处理后,用无菌水洗5次。将蒴果表面的水分用无菌吸水纸吸干,放入无菌平皿中备用。用无菌镊子挑开果荚,均匀撒播于1/2MS培养基上,每个处理接15瓶。14d内的污染率和萌发瓶数。

1.2.3种子萌发诱导培养基筛选试验在无菌培养皿上用无菌镊子挑开果荚,夹着开裂的果荚靠培养瓶口内侧边缘轻轻敲击,让盘龙参种子均匀散落,种子萌发以1/2MS为基本培养基,选用激素NAA、6-BA和添加物马铃薯汁、香蕉汁作4因子3水平正交试验,共9个处理,每处理组接种5瓶。所有培养基中均添加30.0g/L蔗糖和4.0g/L琼脂粉,调pH值至5.6~5.8,光照时间为12h/d,光照强度2000~2500lx,培养温度24℃~26℃(下同)。培养60~70d后每瓶种子的萌发率,筛选合适的种子诱导培养基。

1.2.4原球茎增殖试验种子在萌发培养基上诱导产生的原球茎转接到含NAA与6-BA不同组合的1/2MS+3%蔗糖+15%马铃薯汁+4.0g/L琼脂粉的培养基上,pH值5.8,60d后根据原球茎的增殖率=(原球茎总数-接种数)/接种数,先筛选出最佳激素组合的培养基,再添加不同的有机物添加剂如香蕉汁(BE)、苹果汁(AE)、马铃薯提取液(PE),各处理设三个重复,每个重复接种15瓶,每瓶接10个原球茎。根据原球茎的增殖率最终确定原球茎增殖的最佳培养基。

1.2.5原球茎分化一次成苗试验以基本培养基(1/2MS、2/3MS、MS)、NAA(0、0.5mg/L、1.0mg/L)、6-BA(0、0.5mg/L、1.0mg/L)和马铃薯提取液(10%、15%、20%)作4因子3水平正交试验,共9个处理,所有培养基中均添加30.0g/L蔗糖和4.0g/L琼脂粉,pH值5.8。每种组合培养基接20瓶,每瓶接20个原球茎,60d后测定原球茎的分化系数(分化产生芽总数/原球茎总数)。根据分化系数,并结合植株生长状况筛选原球茎分化一次成苗培养基。

1.3数据处理

用DPS软件对数据进行正交试验和Duncan's新复极差检验分析。

2结果与分析

2.1不同灭菌方法对外植体污染率的影响

从外植体消毒时间看,盘龙参种子在0.1%的HgCl2中消毒30min内随着消毒时间的延长污染率降低;消毒30min以上的效果最好,污染率为0%,但萌发瓶数太低;消毒20min,虽然污染率为20%,但萌发的瓶数最多;消毒时间超过30min无污染但同时种子不萌发。鲁松[9]在金线莲种子消毒试验时发现种子在75%乙醇灭菌时间30s、45s、60s处理下污染率无显著差异,酒精穿透力很强,时间过长会损伤外植体,一般酒精消毒不超过60s为宜。因此我们选择在酒精中消毒30s作为前期的处理,找出种子在0.1%的HgCl2中消毒的最佳时间。外植体消毒不彻底易产生污染,消毒处理时间过长可使盘龙参蒴果因浸泡过度,消毒剂透过种皮毒害种子使种子出现死亡或进入永久休眠状态。外植体消毒处理对盘龙参培养的影响:获得无菌系是组培工作的基础,野生盘龙参生长在阴暗潮湿的自然环境中,除了繁多的伴生真菌与细菌外,还有大量的内生菌,这些微生物不易清除,再加上盘龙参蒴果体积小给组培工作带来极大的困难,本研究采用75%乙醇浸泡30s结合0.1%HgCl2浸泡20min,灭菌效果最好。

2.2植物生长物质对盘龙参种子萌发的影响

将成熟的盘龙参种子播种于萌发培养基上,成熟的盘龙参种子呈粉丝状,黄褐色,60d后培养基上的种子开始萌发,可见白色原球茎(附图)。由表2可见,盘龙参种子在本试验设置的9个培养基配方中均能萌发并发育成苗,香蕉汁对种子萌发的极差最大,是影响盘龙参种子萌发的关键因子,随着香蕉汁浓度的提高,种子萌发率降低;培养基中添加一定浓度的NAA可以促进种子萌发,高浓度6-BA不利于种子萌发,其中不加6-BA的萌发率高;添加马铃薯汁的培养基种子萌发时间早,且原球茎较大,萌发率高。根据各试验因子1、2、3水平下的萌发率均值进行水平选优:NAA选第3水平,即0.5mg/L;6-BA选第1水平,即0mg/L;马铃薯汁选第2水平,即15%;香蕉汁选第1水平,即0%。因此,最适合盘龙参种子萌发的培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁15%。

2.3不同激素组合及不同天然附加物对原球茎增殖的影响

以1/2MS+15%马铃薯汁+3%蔗糖为培养基。不同浓度NAA和6-BA对原球茎的增殖均有促进作用,不同激素组合差异极显著,其中以NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L的增殖效果最好,增殖率为380%。以1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%为培养基,添加不同的天然有机物对盘龙参原球茎增殖的影响试验结果见表4。原球茎接种14d后,原球体表面会产生一些新生的小原球体,呈黄绿色,整齐,部分分化成具有一片小叶的幼苗,在培养基中加入一定量的马铃薯汁后能有效地抑制原球茎褐化,而且能大大增加原球茎的增殖率,且原球茎比苹果汁和香蕉汁的更健壮。3种天然附加物对原球茎增殖的影响差异极显著,以15%马铃薯汁对盘龙参原球茎的增殖促进作用最大,增殖率达380%,极显著高于15%苹果汁和15%香蕉汁,而香蕉汁的效果则差,增殖率为16%,呈黄白色,生长不良。综上所述,盘龙参原球茎增殖的最适培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+马铃薯汁15%+蔗糖3%,pH值5.8。

2.4不同培养基对盘龙参原球茎分化成苗的影响

在9个培养基组合中盘龙参原球茎分化均能不同程度分化成苗,6-BA对原球茎分化的极差值最大,是影响盘龙参分化的关键因子,随着6-BA浓度的提高,原球茎分化系数降低,以不加6-BA的分化系数最高;培养基中添加一定浓度的NAA可以促进原球茎分化,但浓度超过0.5mg/L不利于原球茎的分化;马铃薯提取液也可促进原球茎分化,随着其浓度的提高分化系数也提高。根据各试验因子1、2、3水平下的萌发率均值进行水平选优:基本培养基选第3水平,即1/2MS;NAA选第2水平,即0.5mg/L;6-BA选第1水平,即0mg/L;马铃薯选第3水平,即20%。因此,最适合盘龙参原球茎分化的培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁20%。随着培养时间延长,分化的幼苗不断生长,会出现新的茎段及新叶,在靠近根部的茎节基部处,会长出不定根,形成一完整的植株,4个月后会形成具有多个叶片、有2~3个侧根、株高5~6cm的健壮植株。

3讨论与结论

3.1植物生长调节剂对盘龙参组培苗增殖生长的影响

本试验采用了NAA和6-BA两种植物生长调节剂,添加一定浓度的NAA可以促进种子萌发,高浓度6-BA不利于种子萌发,其中不加6-BA的萌发率高;不同浓度NAA和6-BA组合对原球茎的增殖均有促进作用,差异极显著,其中以NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L的增殖效果最好,增殖率为380%。6-BA对原球茎分化的极差值最大,是影响盘龙参分化的关键因子,随着6-BA浓度的提高,原球茎分化系数降低,以不加6-BA的分化系数最高;培养基中添加一定浓度的NAA可以促进原球茎分化,但浓度不宜超过0.5mg/L。

3.2有机添加物对盘龙参组培的影响

天然添加物在兰科植物组培中较为常用,在本试验中天然添加物对种子萌发和原球茎增殖起到关键的作用,添加马铃薯汁的培养基种子萌发时间早,且原球茎较大,萌发率高;在培养基中加入一定量的马铃薯汁能有效地抑制原球茎褐化,天然附加物对原球茎增殖的影响差异极显著,以15%马铃薯汁对盘龙参原球茎的增殖促进作用最大,增殖率达380%,极显著高于15%苹果汁和15%香蕉汁,而香蕉汁的效果则差,增殖率为16%,呈黄白色,生长不良。本试验以成熟种子为外植体,分别研究了不同基本培养基、激素配比、天然添加物对铁盘龙参种子萌发、原球茎增殖、分化成苗的影响,初步建立了一套比较完整的盘龙参快繁体系。结果表明,种子萌发适宜的培养基配方为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁15%;原球茎在1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁15%的增殖效果最好,增殖率为380%;最适合盘龙参原球茎分化的培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+琼脂4.0g/L+蔗糖3%+马铃薯汁20%。综合来看,通过本试验,种子的萌发率有所提高,但仍然不理想,低于10%,明显低于同是兰科的铁皮石斛和金线莲(达90%以上)。可能是种子的成熟度还不够,使得萌发率受到很大的影响,下一步我们将对组培快繁的各个环节做进一步优化,以提高繁殖系数和质量,为提供适合移栽的组培苗还要进行促壮促根培养。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1999:227-231.

[2]国家医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999.

作者:钟爱清 单位:福建省宁德市农业科学研究所

甘肃中医药大学学报责任编辑:张雨    阅读:人次
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