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丹皮酚药理学实证研究

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牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr·的干燥根皮,其主要生物活性物质为丹皮酚(Paeonia,Pae)〔1〕。Pae药理活性广泛,其中枢镇痛作用与吗啡相比无耐受性、不被纳洛酮影响,其镇痛作用与脑内单胺类递质水平密切相关,是一种非麻醉性镇痛药,适用于慢性钝痛〔2,3〕。目前Pae在小鼠体内药动学研究已有报道,但尚未发现有报道Pae在小鼠组织中分布特点的研究。本实验采用HPLC法测定给药后Pae在小鼠血浆及组织中的分布,探讨Pae在小鼠体内的药代动力学特点。

1材料

1·1仪器TLG-16冷冻高速离心机(湘仪集团);Finnpipette移液枪(美国ThermoFisher公司);AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);玻璃匀浆器;美国Agillent1100液相色谱仪系统。

1·2试药Pae标准品(中国药品生物制品检定所,批号:110708-200506);Pae提取物(实验室自制,纯度:95·504%);乐百氏纯净水;甲醇、乙腈为色谱纯;CMC-Na、氯仿、盐酸等为分析纯。

1·3动物小鼠体重为20~25g,雌雄各半,南京青龙山动物繁殖厂提供,实验室饲养3天后实验。

2方法

2·1实验溶液的配制

2·1·1标准品溶液的制备:精密称取Pae标准品10mg,于100mL容量瓶中,用甲醇溶解、混匀,定容至刻度,即得标准品贮备液。分别量取该贮备液1、2、5、10、15、20mL于100mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,即得浓度为1·0、2·0、5·0、10·0、15·0、20·0μg·mL-1的标准品系列溶液。

2·1·2Pae混悬液的配制:取适量Pae提取物充分研细,精称650mg置100mL量瓶中,加0·5%CMC-Na水溶液至刻度、摇匀,即得6·5mg·mL-1Pae混悬液。

2·2血浆样品及组织样品的处理方法

2·2·1空白血浆加标准品制备:取一定体积Pae标准品溶液置干燥试管中,氮气流干,加空白血浆200μL,涡旋2min,加入400μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r·min-1离心15min,上清液于15000r·min-1离心12min,取上清液20μL进样分析。

2·2·2血浆样品制备:取各小鼠给药后血浆200μL,加入400μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r·min-1离心15min,上清液于15000r·min-1离心12min,取上清液20μL进样分析。

2·2·3空白组织匀浆液加标准品制备:取一定体积Pae标准品溶液置干燥试管中,用氮气吹干,分别加各空白组织匀浆液200μL,涡旋2min,加入400μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r·min-1离心15min,上清液于15000r·min-1离心12min,取上清液20μL进样分析。

2·2·4组织匀浆样品制备:取给药后小鼠心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠匀浆液200μL,分别加400μL乙腈沉淀蛋白,涡旋2min,4000r·min-1离心15min,上清液于15000r·min-1离心12min,取上清液20μL进样分析。

2·3HPLC方法学考察

2·3·1色谱条件:色谱柱:InertsilODS-SP(4·6×150mm,5μm);流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长:274nm;流速:1·0mL·min-1;柱温:30℃;进样量:20μL。

2·3·2检测方法专属性考察:分别取标准品溶液、空白血浆样品、空白血浆加标准品、血浆样品、空白肾组织样品、肾组织样品,按“2·3·1”项色谱条件分析,结果(见图1)。由色谱图知此色谱条件下,血浆及各组织中内源性物质对Pae测定无干扰,样品中Pae得到较好分离,其色谱峰的保留时间与对照品一致。

2·3·3检测限考察:精密量取1·0μg·mL-1的Pae标准品溶液10μL,置干燥试管中,氮气吹干。分别加血浆和各组织匀浆液200μL,制成含Pae为0·05μg·mL-1的样品,同时制备空白血浆样品和空白组织匀浆样品,按“2·2”项处理后,各取20μL进行分析,用信噪比法,取峰高为基线噪音3倍时的浓度为最低检测浓度,得Pae最低检测浓度为0·05μg·mL-1。2·3·4标准曲线的制备:精密量取各Pae标准品溶液80μL,置干燥试管中,用氮气流吹干,加空白血浆0·2mL,涡旋2min,制备成0·4、0·8、2·0、4·0、6·0、8·0μg·mL-1的系列空白血浆标准品溶液,按“2·2·2”项方法处理。按“2·3·1”项色谱条件,测定不同浓度样品中Pae的峰面积。以峰面积(Y)对样品浓度(X)作线性回归,得回归方程为Y=50·245X-25·389,r=0·9995,n=6,表明Pae在0·4~8·0μg·mL-1范围内线性关系良好。

按照“2·2·3”项办法处理、制备空白组织匀浆液加标准品,按“2·3·1”项色谱条件,制备Pae在心、肝、脾、肺、肾、小肠、结肠中的标准曲线,分别为:①心Y=38·784X-7·5064,(0·1~4·0μg·mL-1),r=0·9996,n=6;②肝Y=31·09X-2·0028,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9996,n=6;③脾Y=87·818X-29·116,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9997,n=6;④肺Y=77·341X+0·8087,(0·1~4·0μg·mL-1)r=0·9997,n=6;⑤肾Y=65·282X-2·7899,(0·1~4·0μg·mL-1)r=0·9995,n=6;⑥小肠Y=69·065X-17·85,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9999,n=6;⑦结肠Y=27·249X-10·771,(0·1~8·0μg·mL-1)r=0·9999,n=6。

2·3·5精密度试验:分别精密量取4·0μg·mL-1的血浆标准品溶液20μL,按“2·3·1”项色谱条件,连续进样分析6次,峰面积的RSD为1·89%(n=6)。

2·3·6稳定性试验:分别制备浓度为1·0、8·0、16·0μg·mL-1的空白血浆加标准品溶液,按照“2·2·1”的方法处理,-20℃条件下保存,于0、1、2、4、8、12、24h进样分析,峰面积的RSD为1·67%(n=6)。

2·4动物分组及生物样品预处理小鼠55只,随机分为11组,每组5只,给药前禁食12h,Pae按65mg·kg-1的剂量灌胃给药,于给药后3、5、7、10、15、30、45、60、90、150、240min眼球取血约1mL,置肝素抗凝的离心管内,4000r·min-1条件下离心15min,制备血浆样品,于-20℃冰箱保存。将取血后的小鼠立即处死、解剖,分别取出心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠,用生理盐水洗去表面浮血、滤纸吸干水分后,各组织精密称重。分别取等量小鼠各组织样品于干燥的玻璃匀浆器中,加入1·7mL生理盐水充分研磨,组织匀浆液于4000r·min-1条件下离心15min,上清液置-20℃冰箱保存。

2·5生物样品HPLC检测分别取“2·4”项预处理的血浆样品和组织样品各200μL,按“2·2”项办法处理,样品按“2·3·1”项的色谱条件进样分析。

3结果

实验数据以“均数±标准差(X±S)”表示,血药浓度与时间数据用药物和软件(DAS1·0)进行房室模型拟合并计算药动学参数。

3·1小鼠血浆中Pae含量HPLC法测定血浆中Pae浓度,见表1,平均血药浓度-时间曲线(见图2)。

3·2小鼠灌胃给药房室模型判断及体内药动学参数将小鼠灌胃后血药浓度-时间数据用DAS1·0药动学程序软件进行处理,经模型拟合,结果既有一室型又有二室型。以AIC(拟合精度判据)最小原则为指标,本实验最小AIC=12·92,结果显示:最佳房室模型为一室模型,拟合权重系数W=1,从而确定Pae灌胃给药后在小鼠体内药动学过程符合单室模型。

按单室模型,用DAS1·0药动学程序软件计算小鼠灌胃给药的药动学参数(见表2)。

3·3小鼠组织中Pae的浓度及组织分布情况HPLC法测定给药后心、肝、脾、肺、肾、小肠上端、结肠匀浆液中Pae含量(见表3)。以Pae在各组织中浓度变化的AUC为依据绘制组织分布曲线(见图3)。

4结论

4·1小鼠一次性灌胃给药后,Pae在小鼠体内呈单室模型,其血药浓度-时间曲线类似于静脉给药,即给药后血药浓度很快达到峰值。Pae灌胃给药后1min即可在小鼠血浆中测到原形药,5·3min血药浓度达到峰值,表明Pae口服吸收迅速;150min后血药浓度降至Cmax1/10以下,240min时血药浓度已接近检测限,表明Pae在体内清除速率较快。

Pae经灌胃给药后,在小鼠各组织中的tmax与血药浓度tmax接近,各组织中药物浓度达峰后很快下降,表明Pae在组织中分布快,消除也快;Pae在小鼠体内主要分布在肝,其次是脾、小肠上端、肾、结肠、心、肺。

4·2中药有效成分含量通常较低,进入体内后浓度更低,因此考察不同生物样品处理方法极为重要。生物样品处理方法有蛋白沉淀法、液-固相萃取法、化学衍生化法等〔4〕。本实验采用蛋白沉淀法,对三氯乙酸、甲醇、乙腈、乙醚4种蛋白沉淀剂进行考察,发现乙腈处理时,杂质对Pae测定干扰少,方法简便、准确,重复性好,可满足样品分析要求;实验对乙腈用量进行考察,发现2倍量时既充分沉淀蛋白,且加入体积少,不影响样品测定。

4·3口服药物在设计剂型时要充分考虑到药物的吸收特性:若药物主要在胃肠道上、中部吸收,制剂时主要考虑延长药物在胃肠道上、中部滞留时间;如果药物在全程都有良好吸收,主要考虑使药物均匀释放即可。实验数据显示Pae在小鼠胃肠道全程均有良好吸收特性,但其消除相半衰期较短,在给药后4h,小鼠体内的Pae浓度已接近检测限。Pae及其复方制剂已有片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等多种剂型,服用这些制剂时易出现血药浓度峰谷现象明显等问题。将Pae应用于治疗胃肠道疾病,尤其是结肠部位疾病时,药物在消化道上端吸收速度较快,肝分布较多,使得药物到达结肠局部浓度较低,生物利用度较低,治疗效果较差,故用于肠道疾病治疗时可以考虑将Pae设计为靶向/缓释制剂。

丹皮酚药理学实证研究责任编辑:陈老师    阅读:人次

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